編者注：傅若農(nóng)教授生于1930年，1953年畢業(yè)于北京大學(xué)化學(xué)系，而后一直在北京理工大學(xué)(原北京工業(yè)學(xué)院)從事教學(xué)與科研工作。1958年，傅若農(nóng)教授開始帶領(lǐng)學(xué)生初步進(jìn)入吸附柱色譜和氣相色譜的探索;1966到1976年文化大革命的后期，傅若農(nóng)教授在干校勞動(dòng)的間隙，系統(tǒng)地閱讀并翻譯了兩本氣相色譜啟蒙書，從此進(jìn)入其后半生一直從事的事業(yè)——色譜研究。傅若農(nóng)教授是我國(guó)老一輩色譜研究專家，見證了我國(guó)氣相色譜研究的發(fā)展，為我國(guó)培養(yǎng)了眾多色譜研究人才。

 

第一講：傅若農(nóng)講述氣相色譜技術(shù)發(fā)展歷史及趨勢(shì)

第二講：傅若農(nóng)：從三家公司GC產(chǎn)品更迭看氣相技術(shù)發(fā)展

第三講：傅若農(nóng)：從國(guó)產(chǎn)氣相產(chǎn)品看國(guó)內(nèi)氣相發(fā)展脈絡(luò)及現(xiàn)狀

第四講：傅若農(nóng)：氣相色譜固定液的前世今生

第五講：傅若農(nóng)：氣-固色譜的魅力

第六講：傅若農(nóng)：PLOT氣相色譜柱的誘惑力

第七講：傅若農(nóng)：酒駕判官—頂空氣相色譜的前世今生

第八講：傅若農(nóng)：一掃而光——吹掃捕集-氣相色譜的發(fā)展

第九講：傅若農(nóng)：凌空一瞥洞察一切——神通廣大的固相微萃取（SPME）

第十講：傅若農(nóng)：扭轉(zhuǎn)乾坤—神奇的反應(yīng)頂空氣相色譜分析

前言

　　脂質(zhì)是一類自然界存在的疏水或兩性、難溶于水而易溶于非極性溶劑的有機(jī)物小分子，存在于大多數(shù)生物體系中。脂質(zhì)是細(xì)胞膜的骨架物質(zhì)和第二能量來(lái)源，還參與細(xì)胞的許多重要功能，人類許多重大疾病都與脂質(zhì)代謝紊亂有關(guān)，如糖尿病、肥胖病、癌癥、阿茲海默癥、以及一些傳染病等，

　　作為代謝組學(xué)的重要分支之一，脂質(zhì)組學(xué)(Lipidomics)的研究對(duì)象是生物體的所有脂質(zhì)分子，并以此為依據(jù)推測(cè)其它與脂質(zhì)作用的生物分子的變化，進(jìn)而揭示脂質(zhì)在各種生命活動(dòng)中的重要作用機(jī)制。脂質(zhì)組學(xué)是總體研究和這些疾病有關(guān)的脂質(zhì)化合物，找到昭示這些疾病的生物標(biāo)記物。

　　2005年國(guó)際上把組織、細(xì)胞中的脂質(zhì)分子分為8大類(J Lipid Res 2009,50(Supp);9-14)，有明確結(jié)構(gòu)的脂質(zhì)化合物已經(jīng)有38000個(gè)(BMC Bioinformatics 2014, 15(Suppl 7):S9)，這8類脂質(zhì)分子見表1。

表 1 8大類脂質(zhì)分子

類別	縮寫	數(shù)據(jù)庫(kù)中的結(jié)構(gòu)數(shù)量
脂肪酰類(Fatty acyls)	FA	2678
甘油脂類(glycerolipids )	GL	3009
甘油磷酸脂類(glycerophospholipids)	GP	1970
鞘脂類(sphingolipids )	SP	620
固醇脂類(sterol lipids )	ST	1744
異戊烯醇脂類(prenol lipids ()	PR	610
糖脂類(saccharolipids )	SL	11
多聚乙烯類(polyketides )	PK	132

　　在過(guò)去，由于技術(shù)限制人們難以分析數(shù)量巨大的脂質(zhì)分析，因?yàn)槎喾N脂質(zhì)代謝產(chǎn)物的物理性質(zhì)需要大批純化系統(tǒng)、分離的復(fù)雜技術(shù)操作。2003年韓賢林等繼基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)等之后提出脂質(zhì)組學(xué)(lipidomics)(Han X et a1.J Lipid Res，2003，44：1071)，脂質(zhì)組學(xué)的發(fā)展推動(dòng)了新分析平臺(tái)的研發(fā)，特別是在質(zhì)譜法領(lǐng)域，該方法已使這些操作合理化，并且已允許更多的脂質(zhì)分子得到非常詳細(xì)的分析。

　　脂質(zhì)存在于細(xì)胞、細(xì)胞器和細(xì)胞外的體液如血漿、膽汁、乳、腸液、尿液中。若要研究某一特定部位的脂質(zhì)，首先要將這部分組織或細(xì)胞分離出來(lái)。由于脂質(zhì)不溶于水，通常采用有機(jī)溶劑進(jìn)行萃取。傳統(tǒng)的萃取劑是氯仿、甲醇和水的混合液。所需的樣品在這種混合液中提取所有脂質(zhì)，向提取液中加入過(guò)量的水使之分成2個(gè)相，上面是甲醇和水，下面是氯仿。脂質(zhì)就留在氯仿相，蒸發(fā)濃縮后，使之干燥就得到所需的脂質(zhì)。這種脂質(zhì)提取方法，能夠提出組織樣品中的總脂。這種方法降低了脂質(zhì)的損失率，操作簡(jiǎn)便，而且提取效果較好。對(duì)于只檢測(cè)總脂中的部分脂質(zhì)，固相萃取(SPE)是一種較好的方法，利用固體吸附劑將液體樣品中的目標(biāo)化合物吸附，與樣品的基體和干擾物分離，然后再用洗脫液洗脫或加熱解吸附，達(dá)到分離和富集目標(biāo)化合物的目的。固相萃取技術(shù)設(shè)備要求低，操作簡(jiǎn)單，能快速分離組分復(fù)雜及含量低的樣品。當(dāng)然由于化學(xué)分析樣品前處理技術(shù)的發(fā)展，有許多其他可用的樣品前處理方法。

　　總體上對(duì)脂質(zhì)組學(xué)的研究Chin Chye Teo等歸納為如下的工作流程，第一步就是對(duì)樣品的處理。

1、脂質(zhì)組學(xué)研究的工作流程

　　根據(jù)Chin Chye Teo的綜述報(bào)告(Chin Chye Teo et al,TrAC,2015,65:1-18)，脂質(zhì)組學(xué)研究的工作流程如下表1.

表1 脂質(zhì)組學(xué)研究的工作流程

從患者得到脂質(zhì)組學(xué)研究的樣品
液體	固體
體液，淚水，血清，血漿，尿液 （低溫保存樣品）	細(xì)胞，組織，器官
對(duì)上述樣品進(jìn)行萃取方法
對(duì)極性化合物，單獨(dú)的有機(jī)化合物進(jìn)行： 液-液萃取，固相萃取	對(duì)能源性物質(zhì)進(jìn)行：加壓液相萃取，微波輔助萃取，超聲輔助萃取
萃取得到的脂質(zhì)化合物
使用色譜方法分離：氣相色譜，液相色譜，電泳	不使用色譜方法分離：直接進(jìn)樣，成像
上述分離或未分離樣品進(jìn)行質(zhì)譜分析
質(zhì)譜分析的接口	質(zhì)量分析器
電子轟擊電離（EI），電噴霧電離（ESI），化學(xué)電離（CI），大氣壓（APCI）化學(xué)與電離,基質(zhì)輔助激光解析電離（MALDI）	四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜（qTOF）,三重四級(jí)桿質(zhì)譜（ qqq）,軌道阱質(zhì)譜（Orbitrap）
質(zhì)譜原始數(shù)據(jù)語(yǔ)預(yù)處理 （利用商品或自制軟件）
分類和脂質(zhì)鑒定（使用各種資源如LIPID maps,Lipid Bank,Lipid Blast）
判定在疾病中的機(jī)制/在疾病演化中的作用
為進(jìn)一步診斷找出生物標(biāo)記物（預(yù)防），提供藥物治療的指導(dǎo)

2、脂質(zhì)組學(xué)的樣品制備

　　本文只講脂質(zhì)組學(xué)的樣品制備，Chin Chye Teo等總結(jié)了近年在脂質(zhì)組學(xué)研究中使用的樣品處理方法，見表2.

表2 脂質(zhì)組學(xué)研究中的樣品處理方法比較(Chin Chye Teo et al,TrAC,2015,65:1-18) 

萃取方法	臨床樣品類型 （生物液體或固體）	優(yōu)點(diǎn)	缺點(diǎn)	原文文獻(xiàn)編號(hào)
單一有機(jī)溶劑萃取（SOSE）	血清（生物液體）   皮膚（固體）	容易完成 萃取時(shí)間短 成本低 低溫適于熱敏感化合物 無(wú)需外部能量	使用有毒有機(jī)溶劑 分析時(shí)難以擺脫使用有機(jī)溶劑	1.2   3
液-液萃取（LLE）	眼淚（生物液體） 血清（生物液體） 血漿（生物液體） 尿液（生物液體） 滑液（生物液體） 動(dòng)脈粥樣硬化血小板（生物液體） 皮膚（固體） 組織（固體）	易于建立的方法 容易完成 設(shè)備便宜 萃取時(shí)間短 使用廉價(jià)溶劑（如甲醇，水） 低溫適于熱敏感化合物 無(wú)需外部能量 萃取時(shí)間短	使用大量有毒有機(jī)溶劑 常使用超過(guò)一種類型的溶劑 需要排除溶劑以免影響分析	2 4,9-13 5,14-22 8,23 7 24   25-27 28,29
固相萃取（SPE）	血清（生物液體） 血清（生物液體） 血漿（生物液體） 眼（固體） 皮膚（固體）	容易完成 清除干擾基體 EPE的選擇 低溫適于熱敏感化合物 萃取時(shí)間短	SPE萃取小柱比較貴 需要洗掉有機(jī)溶劑以免影響分析 使用有毒有機(jī)溶劑 分析時(shí)難以擺脫使用有機(jī)溶劑	1,12 2 30 26 3,27
固相微萃取（SPME）	肺（固體） 頭發(fā)（固體）	容易完成 可與GC和GC xGC 聯(lián)用 對(duì)揮發(fā)性化合物可以進(jìn)行頂空氣相色譜 有毒溶劑消耗量少 低溫適于熱敏感化合物 無(wú)需外部能量 萃取時(shí)間短	萃取頭比較貴 需要洗掉有機(jī)溶劑以免影響分析 分析時(shí)難以擺脫使用有機(jī)溶劑	31 32
超臨界流體萃取（SFE）	血漿（生物液體）	容易完成 萃取時(shí)間短 對(duì)非極性化合物萃取效率高 CO2可循環(huán)使用 溫度壓力可控 可加改性劑提高萃取液極性和效率	要精心操作 設(shè)備昂貴	33
微波輔助萃取（MAE）	血漿（生物液體） 皮膚（固體）	容易完成 萃取時(shí)間短 萃取效率高 萃取溶劑消耗量少 溫度壓力可控	需要冷卻防止溶劑逃逸 購(gòu)買設(shè)備費(fèi)用高	34   35
超聲輔助萃取（UAE）	血（生物液體）	容易完成 萃取時(shí)間短 萃取溶劑消耗量少 溫度壓力可控	聽力會(huì)受損 要使用有毒有機(jī)溶劑 會(huì)吸入有害溶劑 需要外部能源 購(gòu)買設(shè)備費(fèi)用高 提高溫度會(huì)使化合物降解	36,37

3、脂質(zhì)組學(xué)的溶劑萃取

　　液-液萃取是脂質(zhì)組學(xué)研究中使用最為普遍的方法，這一方法是使用兩種互不混溶的有機(jī)溶劑——使用最多的是氯仿、甲醇和水——為了對(duì)關(guān)鍵脂質(zhì)類得到最大的萃取效率，從磷脂類和糖脂類到脂肪酸，三酰基甘油類(TAGs)、二酰基甘油類(DAGs)。最初使用的是Folch 脂質(zhì)萃取法(氯仿/甲醇/水為 8:4:3 v/v/v)，之后有Bligh 和 Dyer脂質(zhì)萃取法(氯仿/甲醇/水為 1:2:0.8 v/v/v)。

　　(1)Folch 脂質(zhì)萃取法(Folch et al., J Biol Chem 1957, 226： 497)

　　把樣品組織用2:1氯仿/甲醇均一化，最后的溶劑體積是組織的20倍(20mL 溶劑里有1g樣品)，分散均勻后于室溫下把混合物在軌道振蕩器上震動(dòng)15-20min。均勻混合物經(jīng)漏斗中折疊濾紙過(guò)濾，或進(jìn)行離心處理，回收液相。

　　液相溶劑用0.2體積的水(20 mL液相使用4 mL水)，最好使用0.9%的NaCl溶液洗滌，渦旋幾秒后在低速離心機(jī)(2000 rpm)上離心混合物，用虹吸方法棄去上層液相，用以分析神經(jīng)節(jié)糖苷或小分子有機(jī)極性化合物，如需要(需移去標(biāo)記分子)，用1:1甲醇/水洗滌交界處的有機(jī)相兩次，無(wú)需混合全部制備物。

　　經(jīng)離心分離后虹吸掉上面的液相，下面含有脂質(zhì)的氯仿在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中真空蒸發(fā)，或用氮?dú)獯捣鞯?-3 mL體積。

　　(2)Bligh 和 Dyer脂質(zhì)萃取法(Can J Biochem Physiol 37:911-917)

　　a. 每1 mL 樣品加入3.75mL 1:2(v/v) CHCl3:CH3OH 很好渦旋，如果要進(jìn)行GC 分析，溶劑中要含有內(nèi)標(biāo)(如0.5μg谷甾醇)

　　b. 然后加入1.5mL CHCl3很好渦旋

　　c. 最后加入1.25mL蒸餾水很好渦旋

　　d. 在1000rpm離心機(jī)中室溫下離心5min，得到一個(gè)兩相分離(上層為水相，下層為有機(jī)相)的液體

　　e. 回收有機(jī)相：用一個(gè)巴斯德吸管(Pastuer pipette)通過(guò)上層水相，輕微施加正壓避免上層水相浸入吸管，吸管口到達(dá)離心管底部，吸取下層有機(jī)相溶液的90%到吸管中。

下表列出不同樣品容積需要加入的試劑量

　　如果你要得到干凈的底部的有機(jī)相溶液，就要用上層“真正”的上層液相洗滌有機(jī)相溶液，方法如下：

　　a 制備“真正”的上層液相：取一個(gè)大的玻璃管，或者幾個(gè)常規(guī)玻璃管，以水代替樣品胺上述方法進(jìn)行萃取操作，把幾個(gè)管子中的上層水相合并在一起備用。

　　b 把上述第5步得到的底層溶液倒入一個(gè)玻璃管中，然后加入適量(樣品+蒸餾水的體積)“真正”的上層液相。比如你是1 mL樣品就加入2.25mL“真正”的上層液相。

　　c 好好地渦旋，離心，收集下層相。

　　Cui等的改進(jìn)Bligh 和 Dyer脂質(zhì)萃取法(Cui L，e al, PLoS Negl Trop Dis，2013，7：e2373)：

　　900µL氯仿-甲醇(1:2)加入到100 µL樣品中，進(jìn)行渦旋，在4°C下保溫，然后加入300µL氯仿和300µL雙重蒸餾水，以9000 rpm離心2 min，脂質(zhì)物在離心管底部的有機(jī)相中，然后加入500 µL氯仿在4°C下進(jìn)行渦旋20 min。從有機(jī)相中回收脂質(zhì)物并與前次得到的脂質(zhì)物合并，脂質(zhì)萃取物經(jīng)真空干燥后于−80°C下存放備用。

　　多少年來(lái)人們使用類似于上述方法進(jìn)行脂質(zhì)的萃取，例如：李國(guó)琛等在脂質(zhì)組學(xué)研究中也采用Bligh 和 Oyer法萃取磷脂，并作適當(dāng)改進(jìn).他們的方法是：

　　稱取100 mg魚肉樣品，加入400 p,L甲醇/氯仿(體積比2：1)，渦旋混勻后，于一30℃放置過(guò)夜.取出后于4℃以10000 轉(zhuǎn)速離心5 min.將上清液轉(zhuǎn)出，在殘?jiān)屑尤?00 mL甲醇/氯仿(體積比2：1)再次提取，將2次所得上清液合并.在上清液中先后加入100 mL氯仿及100mL水，離心后，將磷脂所在的氯仿相與水相分離.采用真空離心蒸發(fā)濃縮器干燥氯仿相(溫度不超過(guò)45℃，下同)，將干燥后的樣品于一30℃保存?zhèn)溆?(高等學(xué)校化學(xué)學(xué)報(bào)，2010,31(2)：269-273)

　　人們?yōu)榱颂岣吣承┲|(zhì)種類的萃取效率，改變氯仿/甲醇/水的比例，并加入一些其他添加劑，如乙酸、鹽酸等，探索改進(jìn)萃取各類脂質(zhì)化合物的得率，如酸性磷脂和脂肪酸。(Jensen S K, Lipid Technol，2008， 20： 280–281)。

HCl-Bligh萃取法步驟：

　　為了更好地萃取生物樣品中的脂肪酸，使用加鹽酸的HCl-Bligh萃取法：取0.6 g均勻好的樣品裝入10-ml 帶蓋的培養(yǎng)試管中，加如1 ml 3M HCl，在80℃水浴上加熱1 h，之后加入1.50 ml甲醇和1.00 ml氯仿，以及17:0脂肪酸內(nèi)標(biāo)，把混合物搖震1 min，然后加入ELGA-純水系統(tǒng)制備的純水1.00 ml 和2.00 ml氯仿，把試管振蕩1 min，然后在3000 rpm離心機(jī)上進(jìn)行離心處理5 min。把1 ml氯仿相進(jìn)行甲基化，用氮?dú)獍崖确抡舭l(fā)掉，加入0.8 ml NaOH/甲醇溶液，把試管充滿氮?dú)猓芊庠?00 ℃下烘箱中15 min，冷卻后加入1 ml BF3溶液，密封在100 ℃下烘箱中45 min。在冷卻后加入2 ml辛烷和4 ml飽和NaCl溶液，把混合物進(jìn)行渦旋，在3000 rpm離心機(jī)上進(jìn)行離心處理10 min。用1μL 樣品進(jìn)行氣相色譜分析。

　　根據(jù)Jensen的研究，認(rèn)為此方法可以對(duì)脂肪酸的萃取率提高15%，對(duì)多不飽和脂肪酸的萃取率可提高30-50%。

　　由于氯仿的毒性大人們就用二氯甲烷來(lái)代替氯仿(J Agr Food Chem,2008,56:4297-4303)，之后就有許多研究者效仿用以萃取臨床樣品，包括生物液體，如血清/血漿，尿液和固體樣品，如皮膚和動(dòng)脈粥樣硬化血小板(表中文獻(xiàn)4,5,8,9,10,14-17,23-25,28).

　　近幾年也用甲基特丁基醚(MTBM )做萃取溶劑代替氯仿(Matyash et al. J Lipid Res. 2008，49 (5) ：1137–1146.)。Matyash 認(rèn)為MTBM進(jìn)行萃取快速而且可以得到干凈的脂質(zhì)，可以適合于自動(dòng)進(jìn)行鳥槍法得到脂質(zhì)輪廓。因?yàn)镸TBM的密度低，水相和有機(jī)相分開時(shí)，有機(jī)相在上層，這樣簡(jiǎn)化了手機(jī)有機(jī)相的手續(xù)，減少了吸取的損失，不可萃取的基質(zhì)小球處于離心管的底部，易于去除。嚴(yán)格的測(cè)試證明MTBM進(jìn)行萃取對(duì)絕大多數(shù)脂質(zhì)種類和“黃金標(biāo)準(zhǔn)”Folch 或 Bligh and Dyer萃取方法類似或更好。2013年中科院大連化學(xué)物理研究所許國(guó)旺和德國(guó)圖賓根大學(xué)醫(yī)學(xué)院的R Lehmannb使用MTBM進(jìn)行萃取開創(chuàng)了一個(gè)從一小片肝臟或肌肉組織同時(shí)進(jìn)行道謝組學(xué)和脂質(zhì)組學(xué)的研究(J Chromatog A, 2013， 1298：9– 16)

　　人們的思路總是由簡(jiǎn)單到復(fù)雜，又由復(fù)雜回歸到簡(jiǎn)單，所以脂質(zhì)組學(xué)中的萃取方法，近來(lái)也有多種溶劑向單一溶劑發(fā)展， Stübiger G (表中文獻(xiàn)1)就使用 Zhao Z等提出的單一溶劑萃取(SOSE)磷脂類脂質(zhì)(J Lipid Res 2010;51:652)方法如下：

　　把500 mL甲醇加入到20 mL人血漿中，其中已經(jīng)含有0.01% BHT(2,6-二叔丁基對(duì)甲酚)和0.5 mmol EDTA (用作抗氧化劑)和3mmol Pefablock(4-(2 aminoethyl) benzenesulfonylfluoride hydrochloride)用作磷脂酶的抑制劑，加入內(nèi)標(biāo)物，把樣品激烈震蕩1min，在冰浴中放置30 min，進(jìn)行脂質(zhì)的萃取，之后在10,000 rpm離心機(jī)上，離心5 min(4℃)，最后把離心管上面的液體小心滴轉(zhuǎn)移到2 mL玻璃樣品瓶中，在零下70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

4、固相萃取(SPE)

　　SPE 是十分成熟的樣品預(yù)處理技術(shù)，使用裝有固定相的小柱子和各種流動(dòng)相選擇性地保留與固定相有特定作用力的特殊種類分子。SPE的典型應(yīng)用是和 SOSE 和 LLE相結(jié)合，作為一種附加的凈化步驟或從生物液體或固體住址樣品中富集某種特定種類的目標(biāo)脂質(zhì)(表中文獻(xiàn)1,3,12,26,27)，市場(chǎng)有各種各樣的萃取小柱供選擇。供脂質(zhì)萃取的SPE小柱有正相硅膠柱和反相柱(C8 和 C18)，以及離子交換柱(氨丙基柱)，硅膠柱和氨丙基柱多用于分離中性和極性脂質(zhì)，利用改變洗脫溶劑以達(dá)到分離的目的。而C8 和 C18柱用于從水基樣品中分離卵磷脂(PC)、腦苷脂、神經(jīng)節(jié)糖苷和脂肪酸。

　　針對(duì)不同的脂質(zhì)使用不同的SPE，如 Stübiger(表2文獻(xiàn)1)在進(jìn)行導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化的磷脂的研究中，使用C18 凈化柱從血漿脂質(zhì)萃取和富集體液氧化磷脂(OxPLs)，其步驟如下：

　　把脂質(zhì)萃取液倒入微量制備高效固相萃取柱(mHP-SPE)C18 spin-columns (PepClean, Pierce)中，小柱事先用500mL MeOH：0.2%甲酸(70:30 重量比)洗滌，然后用700 mL MeOH:0.2%甲酸(82:18 重量比)洗脫一次，再用800 mL MeOH:0.2%甲酸(92:2 重量比)洗脫一次，最后小柱用500 mL 2-丙醇再生，以便從小柱中徹底清除脂質(zhì)(即中性脂質(zhì))，凈化后的純度用薄層色譜檢查，得到的氧化脂質(zhì)用LC-ESI-MS/MS進(jìn)行分析。

　　而Ruben t’Kindt進(jìn)行皮膚神經(jīng)酰胺的脂質(zhì)組學(xué)研究中，則使用氨丙基硅膠小柱對(duì)脂質(zhì)萃取液進(jìn)行凈化(表2文獻(xiàn)3)，方法如下：

　　使用氨丙基硅膠小柱(100 mg, 3.0 mL)先用2 mL己烷洗滌，把已經(jīng)干燥的脂質(zhì)溶于300 μL 11:1 的己烷：異丙醇(v/v)中，用2 mL己烷/甲醇/氯仿(80/10/10 (v/v))洗脫神經(jīng)酰胺，用氮?dú)獯祾吒稍铮苡?00 μL異丙醇/氯仿(50/50)(v/v)中，進(jìn)行HPLC/MS分析。

5、固相微萃取(SPME)

　　Pawliszyn 研究組在1991年發(fā)明了SPME，1993年出現(xiàn)了SPME的商品化產(chǎn)品，使之成為廣泛使用的樣品前處理技術(shù)。這一方法是集萃取、濃縮、解吸、進(jìn)樣于一體，它以固相萃取(SPE)為基礎(chǔ)，保留了SPE的全部?jī)?yōu)點(diǎn)，排除了需要柱填充物和使用有機(jī)溶劑進(jìn)行解吸的缺點(diǎn)。SPME是以涂漬在石英玻璃纖維上的固定相(高分子涂層或吸著劑)作為吸收(吸附)介質(zhì)，對(duì)目標(biāo)分析物進(jìn)行萃取和濃縮，并在氣相色譜進(jìn)樣口中直接熱解吸(或用HPLC流動(dòng)相沖洗到液相色譜柱中，甚至可以直接進(jìn)行質(zhì)譜分析)，這一技術(shù)適合于揮發(fā)性和半揮發(fā)性有機(jī)物的樣品處理和分析。SPME有8大優(yōu)點(diǎn)：1 操作簡(jiǎn)單，2 功能多樣，3 設(shè)備低廉，4 萃取快捷，5 無(wú)需溶劑，6 可在線、活體取樣，7 可自動(dòng)化， 8 可在分析系統(tǒng)直接脫附。SPME可以對(duì)環(huán)境中的污染物進(jìn)行檢測(cè)，如：農(nóng)藥殘留、酚類、多氯聯(lián)苯、多環(huán)芳烴、脂肪酸、胺類、醛類、苯系物、非離子表面活性劑以及有機(jī)金屬化合物、無(wú)機(jī)金屬離子等，也可以用有類似特點(diǎn)的領(lǐng)域，如食品、醫(yī)藥、臨床、法庭分析等方面。自然，在脂質(zhì)組學(xué)中也會(huì)使用這一技術(shù)。

　　武漢大學(xué)曾昭睿研究組用自制的甲基丙烯酸丁酯/端羥基硅油萃取頭，萃取肺組織中的長(zhǎng)鏈脂肪酸(表2文獻(xiàn)31)。F Pragst 利用SPME萃取頭發(fā)中的脂肪酸乙酯和葡萄糖苷酸乙酯來(lái)診斷過(guò)度酗酒(表2文獻(xiàn)32)。脂質(zhì)中的脂肪酸都可以衍生化為酯類用SPME進(jìn)行萃取。

　　SPME 的魅力在于它可以進(jìn)行活體樣品中萃取分析物，用于代謝組學(xué)和脂質(zhì)組學(xué)的研究，對(duì)這一課題SPME的發(fā)明人 Pawliszyn 近年進(jìn)行了闡述(Angew Chem， 2013, 125：12346 –12348;Anal Chem， 2014, 86：12022−12029)。分析脂質(zhì)代謝產(chǎn)物中游離脂肪酸的示意圖如下。

(Anal Chem， 2014, 86：12022−12029)

6、超臨界流體萃取(SFE)

　　超臨界流體具有特殊的理化特性，黏度為普通流體的1%～10%;擴(kuò)散系數(shù)約為普通液體的10～100倍;密度比常壓氣體大100～1 000倍。因而超臨界流體既有液體溶解能力大的特點(diǎn)，又有氣體易于擴(kuò)散和運(yùn)動(dòng)的特性，傳質(zhì)速率大大高于液相過(guò)程。所以從萃取效率和對(duì)環(huán)境友好都受到歡迎。最常用的超臨界流體是超臨界二氧化碳(SF-CO2)它的臨界壓力和溫度低，只有7.4MPa和32℃。SF-CO2無(wú)毒易于從樣品中排除，其極性與戊烷近似，很適于萃取疏水性化合物，如脂質(zhì)化合物(J Chromatogr A 2007,1163:2-24)。為了分離極性化合物往二氧化碳中加入改性劑，如甲醇。過(guò)去更多的工作時(shí)從植物類物質(zhì)中萃取脂質(zhì)，但是近來(lái)已經(jīng)擴(kuò)展到從動(dòng)物組織中萃取脂質(zhì)，例如浙江大學(xué)藥學(xué)院王龍虎利用江蘇省南通市華安超臨界萃取有限公司的 HA220-50-06 SFE裝置萃取鴕鳥脂肪中的脂肪酸：萃取裝置包括一個(gè)1 L 不銹鋼萃取釜，兩個(gè)1 L 分離器，一個(gè)注射泵，和一個(gè)冷凝裝置。用壓力調(diào)節(jié)器調(diào)節(jié)壓力，用可調(diào)節(jié)溫度的水浴控制溫度，通過(guò)調(diào)節(jié)泵的頻率來(lái)控制二氧化碳的流速。從液態(tài)二氧化碳鋼瓶把二氧化碳送到萃取器中，并達(dá)到超臨界狀態(tài)，在分離器中調(diào)節(jié)壓力和溫度可把萃取出來(lái)的組分里出來(lái)。試驗(yàn)中取250 g鴕鳥脂肪組織用二氧化碳萃取5h，壓力15–30 MPa，溫度40–50℃，二氧化碳流速為15–35 L/h，用以考察萃取效果。(Eur. J. Lipid Sci. Technol. 2011, 113, 775–779)。

　　但是SFE更重要的是萃取人干血漿斑點(diǎn)中的脂質(zhì)分子，Uchikata等(表2文獻(xiàn)33)比較了用SFE和液液萃取(Bligh 和 Dyer方法)磷脂的效果，證明SFE要比液液萃取方法對(duì)磷脂具有更好的選擇性，包括磷脂酰膽堿(PC)、溶血性磷脂酰膽堿(lysoPC)、磷脂酰乙醇胺(PE)和神經(jīng)鞘磷脂(SM)。國(guó)內(nèi)在1995年就有類似研究(薄層掃描法測(cè)定蛋黃磷脂中PC、SM和LPC的含量­——路萍 賴炳森，藥物分析雜志，1995，(13):231-232)，他們也是用SFE萃取之后進(jìn)行薄層色譜分離。

7、微波輔助萃取(MAE)

　　微波輔助萃取(MAE)是利用微波能強(qiáng)化溶劑萃取效率，即利用微波加熱來(lái)加速溶劑對(duì)固體樣品中目標(biāo)萃取物的萃取過(guò)程。MAE 可以快速高效地把樣品及溶劑中的偶極分子在高頻微波能的作用下，產(chǎn)生偶極渦流，離子傳導(dǎo)和高頻率摩擦，從而在短時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生大量的熱量。偶極分子旋轉(zhuǎn)導(dǎo)致的弱氫鍵破裂、離子遷移等加速了溶劑分子對(duì)樣品基體的滲透，待分析成分很快溶劑化，使微波萃取時(shí)間顯著縮短。

　　微波加熱具有選擇性微波對(duì)介電性質(zhì)不同的物料呈現(xiàn)出選擇性的加熱特點(diǎn)，介電常數(shù)及介質(zhì)損耗小的物料，對(duì)微波的入射可以說(shuō)是“透明”的。溶質(zhì)和溶劑的極性越大，對(duì)微波能的吸收越大，升溫越快，促進(jìn)了萃取速度。而對(duì)于不吸收微波的非極性溶劑，微波幾乎不起加熱作用。所以，在選擇萃取劑時(shí)一定要考慮到溶劑的極性，以達(dá)到最佳效果。

　　MAE具有生物效應(yīng)(非熱效應(yīng)) ，由于大多數(shù)生物體內(nèi)含有極性水分子，在微波場(chǎng)的作用下引起強(qiáng)烈的極性震蕩，從而導(dǎo)致細(xì)胞分子間氫鍵松弛，細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)電擊穿破裂，加速了溶劑分子對(duì)基體的滲透和待提取成分的溶劑化。因此，利用MAE從生物基體萃取待分析的成分時(shí)，能提高萃取效率。(李核等，分析化學(xué)，2003,31(109)：126l～1268)

　　例如：萬(wàn)益群，吳世芳利用MAE萃取何首烏中的磷脂(分析測(cè)試學(xué)報(bào)，2008,27(7)：782—784)，方法如下：確稱取約1.0 g何首烏樣品于溶樣杯中，加入20 mL萃取溶劑(氯仿與甲醇體積 比為1：2)，把溶樣杯放入罐體中，組裝好罐體后放入微波制樣系統(tǒng)中，插入溫度探針。設(shè)置萃取壓力為安全壓力(1.5 MPa)，萃取時(shí)間15 min，溫度為45℃。微波萃取完畢后，將樣品過(guò)濾。濾液用體積為濾液總體積l/4的8 g/L氯化鈉溶液萃取2次，收集有機(jī)相。將有機(jī)相旋轉(zhuǎn)濃縮至近干，用甲醇定容至10 mL。取樣品溶液3 mL用甲醇稀釋至10 mL，過(guò)0.45μm微孔濾膜，待測(cè)。

7、超聲輔助萃取(UAE)

　　超聲波為頻率高于20kHz以上的聲波，是一種機(jī)械振動(dòng)在介質(zhì)中的傳播過(guò)程，在傳播過(guò)程中，超聲波與介質(zhì)的相互作用，可以使超聲波的相位和幅度等發(fā)生變化;功率超聲波則會(huì)使介質(zhì)的狀態(tài)、組成、結(jié)構(gòu)和功能等發(fā)生變化，超聲萃取中的應(yīng)用可分為兩類：一類是頻率高，能量低(一般小于1W/cm2)的檢測(cè)超聲波，其頻率多以MHz為單位;另一類是頻率低，能量高(通常為10—100 W/cmz)的功率超聲波，其頻率則以kHz為單位。UAE是一種重復(fù)性好、萃取質(zhì)量高的方法，它不像MAE，不會(huì)讓萃取系統(tǒng)的溫度升高，不利于熱穩(wěn)定差的代謝物萃取。UAE還可以和液液萃取配合改進(jìn)生物樣品中脂質(zhì)的萃取效率。例如上海交通大學(xué)藥學(xué)院的劉玉敏等(Anal Bioanal Chem，2011， 400：1405–1417)成功地開發(fā)了UAE 和 LLE結(jié)合萃取人血清樣品中的代謝產(chǎn)物，從而比單獨(dú)使用液液萃取脂肪酸提高5–60%。Pizarro等使用類似的方法以MTBE作溶劑輔以UAE萃取人血中的脂質(zhì)，比單純使用MTBE的液液萃取可以多檢出30%的脂質(zhì)種類，MTBE-UAE萃取方法具有更好的重復(fù)性，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差降低6%，脂質(zhì)成分的回收率提高7成(表2文獻(xiàn)36)。除去萃取生物液體外，UAE-LLE也用于萃取樣品中的脂肪酸，例如哈爾賓醫(yī)科大學(xué)的李穎等研究了用UAE-LLE萃取鼠的肝臟組織，考察了超聲波功率、萃取溶劑、萃取容積、萃取時(shí)間等，結(jié)果表明萃取時(shí)間比Folch萃取法萃取脂肪酸從12 h 縮短到 20 min，回收率在87–120%之間。(J Chromatogr Sci， 2013;51:376–382)

8、其他可用的萃取方法

　　在化學(xué)分析樣品處理中還有兩種重要的樣品前處理方法，即加速溶劑萃取(ASE)和基質(zhì)固相分散萃取(MSPD)，可以用于脂質(zhì)組學(xué)研究的樣品前處理。

　　加速溶劑萃取(Accelrated Solvent Extraction, ASE)，這一方法是一種在提高溫度和壓力的條件下，用有機(jī)溶劑萃取的自動(dòng)化方法。與其他液體萃取方法相比，其突出的優(yōu)點(diǎn)是有機(jī)溶劑用量少、快速、回收率高。(牟世芬等，現(xiàn)代分析儀器，2001，(3)：18-20)。 Spiric A等使用ASE萃取鯉魚肉中的脂肪酸譜和膽固醇含量，并與改進(jìn)的索氏萃取法進(jìn)行比較，表明ASE萃取方法是可用的。(Anal Chim Acta，2010， 672：66–71)。Jansen B等利用ASE從土壤中萃取脂質(zhì)生物標(biāo)記物，萃取效果和其他萃取方法一樣(Appl Geochem ，2006， 21：1006–1015)。Balasubramanian R K等用ASE和其他方法進(jìn)行了從海水微海藻細(xì)胞中萃取脂質(zhì)的研究，表明ASE是一種可以使用的方法(Chem Engineering J，2013， 215–216：929–936)。

　　MSPD方法是1989年首次提出是用來(lái)處理動(dòng)物組織樣品的方法，樣品與涂漬有C18等的各種聚合物載體的固相萃取材料一起研磨，得到半干狀態(tài)的混合物并將其作為填料裝柱，然后用不同的的溶液洗脫柱子，將各種待測(cè)物洗脫下來(lái)。其依據(jù)是采用脂溶性材料(C18)破壞細(xì)胞膜并將組織分散，C18充當(dāng)分散劑。在硅膠固相萃取材料表面鍵合有機(jī)相，與傳統(tǒng)方法使用砂子做吸附劑類似，在樣品與固體材料攪拌的過(guò)程中，利用剪切力作用將組織分散。鍵合的有機(jī)相就像溶劑或洗滌劑一樣，將樣品組分溶解和分散在支持物表面。這大大增加了萃取樣品的表面積，樣品按各自極性分布在有機(jī)相中，如非極性組分分散在非極性有機(jī)相中，極性小分子與硅膠上的硅烷醇結(jié)合，大的弱極性分子則分散在多相物質(zhì)表面。(烏日娜等，食品科學(xué)，2006,26(6)：266-268)。香港城市大學(xué)的Qing Shen等利用二氧化鈦納米顆粒作萃取劑，以基質(zhì)固相分散萃取方法進(jìn)行橄欖果的脂質(zhì)組學(xué)研究，研究證明這一方法可以把磷脂從非磷脂中完全選擇性地分離出來(lái)。(Food Research Int，2013， 54：2054–2061)。

表2中的文獻(xiàn) 

1	Stubiger G, et al, Atherosclerosis, 2012,224:177–186.
2	Zhao Z, et al, J Lipid Res, 2010, 51:652–659
3	t’Kindt R, et al, Anal  Chem, 2012,84:403–411
4	Cui L, et al, PLoS Negl Trop  Dis，2013，7：e2373
5	Sandra K,et al, J  Chromatogr A，2010，1217：4087–4099.
6	Lam S M, et al, J Lipid Res, 2014,55: 289–298
7	Giera M, et al, Biochim  Biophys  Acta, 2012, 1821:415–424
8	Min H K, Anal  Bioanal Chem, 2011, 399:823–830.
9	Heilbronn L K, et al, Obesity，2013， 21：E649–E659
10	Hilvo M, et al, Int  J  Cancer 134 (2014) 1725–1733
11	Montoliu I, et al, Aging (Albany NY)，2014，6：9–25
12	Chen Y , et al, Clin. Chim. Acta， 2013，428： 20–25.
13	Zivkovic A M, et al, Metabolomics，2009，5：507–516
14	Chen F,et al, Biomarkers, 2011, 16:321–333
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17	Lankinen M, et al, PLoS ONE, 2009,4:e5258.
18	J. Graessler, et al, PLoS ONE,2009, 4:e6261
19	Lofgren L et al,, J  Lipid Res, 2012,53:1690–1700
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